Протеомный анализ слезы у молодых людей, носящих очки, ортокератологические и мягкие контактные линзы


В этой работе опубликованы результаты исследования протеома слезы молодых пациентов, носящих очки, ортокератологические (ОК) линзы и мягкие контактные линзы (МКЛ), с помощью технологии последовательной фрагментации с параллельным накоплением (diaPASEF), не зависящей от данных, и идентифицировано 3406 белковых групп в слезных полосках Ширмера. Наблюдались значительные изменения содержания белка в 19 группах у пользователей ОК-линз и МКЛ. Более того, содержание 82 белковых групп существенно отличалось у детей и молодых людей, носящих очки. В качестве пилотного исследования эта работа обеспечивает глубокий охват протеома слезы и предполагает необходимость изучения реакции глаз на ношение контактных линз (КЛ) у детей и молодых людей по отдельности.

Введение

Жесткие ОК-линзы и МКЛ использовались для замедления прогрессирования миопии, и их применение продолжает расширяться по мере роста эпидемии близорукости [1–4] (Обширный список литературы к статье см. здесь: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391922002627). Распространенность миопии у взрослых увеличилась с 20–30 % в середине XX века до > 80 % в некоторых частях мира сегодня [5]. Несмотря на пользу для замедления прогрессирования миопии, ношение КЛ является наиболее распространенным триггером воспаления поверхности глаза и может приводить к дискомфорту, боли и даже рубцеванию [6, 7]. Исследования показали, что воспалительные явления роговицы, связанные с ношением КЛ, чаще возникали у подростков и молодых людей в возрасте от 15 до 25 лет [8–11]. Более того, осложнения на поверхности глаза, такие как инфекция конъюнктивы и кератит, возникают у 70 % бессимптомных пользователей КЛ [12]. На сегодняшний день влияние ношения таких линз на поверхность глаза на молекулярном уровне до конца не изучено. В этом исследовании мы рассмотрели протеомы слезы молодых пациентов, носящих ОК-линзы, МКЛ и очки, используя протеомные технологии, базирующиеся на масс-спектрометрии, в частности независимый сбор данных (DIA) в сочетании с параллельным накоплением – серийной фрагментацией (PASEF) в режиме сканирования (diaPASEF).

«Омики», основанные на масс-спектрометрии, оказались привлекательным инструментом для понимания физиологии и патологий биологических систем [13, 14]. Различные технологии масс-спектрометрии – масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией при помощи матрицы, нативная масс-спектрометрия и восходящая протеомика – использовались для потенциальной идентификации биомаркеров глазных заболеваний, таких как сухость глаз, дисфункция мейбомие­вых желез (ДМЖ) и глазные инфекции [15–31]. Однако применение масс-спектрометрии в научных исследованиях, направленных на обнаружение биомаркеров и патологии заболеваний, было ограничено из-за ее чувствительности.

Обучение консультантов в статье

Панорамная протеомика добилась значительных успехов благодаря улучшенной чувствительности, разрешению и скорости масс-спектрометров последних поколений [32–35]. Недавно привлекла значительное внимание технология по­движности захваченных ионов, особенно PASEF в режиме сканирования, она имеет высокую скорость, эффективность и чувствительность [36–38]. В дополнение к другому способу измерения разделения подвижных ионов с высокой скоростью PASEF позволяет анализировать одну их совокупность, одновременно собирая другую. Таким образом, параллельно накапливая и анализируя ионы, с помощью PASEF можно достигнуть рабочего цик­ла в 100 % без потери чувствительности [36, 37]. При изготовлении масс-спектрометра timsTOF Pro используется технология PASEF, он обеспечивает высокую скорость сканирования – 100 Гц и рабочий цикл примерно в 100 % за счет соединения с квадрупольным анализатором частиц по времени пролета. Такая высокая скорость сканирования дает значительное преимущество в сборе измерений, зависящем от данных (DDA), поскольку с помощью DDA можно отбирать больше молекул-предшественников, тем самым обеспечивая более высокую идентификацию пептидов. Кроме того, timsTOF Pro, основанный на системе высокого разрешения QTOF [39], отличается улучшенными эффективностью пропускания ионов, разрешающей способностью масс-анализаторов и чувствительностью масс-спектрометрического детектора, чтобы удовлетворить потребность в высокой чувствительности. Благодаря этим уникальным преимуществам timsTOF Pro хорошо подходит для протеомного анализа.

Поскольку DDA предназначен для отбора высокоинтенсивных ионов, DIA фрагментирует все ионы в заданной выборке. Это дает более полные данные и высокую воспроизводимость, благодаря чему DDA хорошо подходит для клинических исследований с большими размерами выборки (по количеству субъектов), а также с малым количеством образцов [40–42]. Объединив преимущества PASEF и DIA, diaPASEF демонстрирует свою способность к глубокому охвату протеома и высокую производительность [43, 44].

В данном исследовании мы использовали diaPASEF для профилирования протеомов слезы молодых пациентов, носящих очки, OK-линзы и МКЛ, а также идентифицировали несколько иммунных/воспалительных и метаболических белков, связанных с возрастом и ноше­нием КЛ.

Материал и методы

Дизайн исследования и сбор образцов

Это исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено комиссией по био­медицинской этике Хьюстонского университета. Перед участием от пациентов было получено письменное согласие. Поскольку среди них находились несовершеннолетние, помимо их согласия, мы также получили разрешение родителей/опе­кунов.

Молодые люди, регулярно пользующиеся очками и КЛ (более 3 лет ношения), отбирались для участия, если они были в возрасте от 10 до 26 лет, имели наи­лучшую корригированную остроту зрения 0,8 или выше на каждом глазу, аномалии рефракции от –0,25 до –5,75 дптр при астигматизме менее 1,75 дптр. Было установлено, что участники, носящие КЛ, пользовались ОК-линзами или МКЛ в течение полного рабочего дня (согласно самоотчетам, более четырех дней в неделю в течение как минимум 3 лет). У них не наблюдалось значительного прокрашивания роговицы или конъюнк­тивы и ДМЖ (≤ степени 1), покраснения поверхности глаза, шероховатости век и покраснения (< степени 2) по шкале Исследовательского центра роговицы и контактных линз (Cornea and Contact Lens Research Unit – CCLRU) [45]. Другими критериями исключения на момент исследования были следующие: активная глазная инфекция или глазные воспалительные заболевания, такие как глазная аллергия или сухость глаз; перенесенная рефракционная/офтальмологическая операция или глазная травма; текущее использование глазных капель, кроме препаратов искусственной слезы; текущее или предыдущее использование аккутана (изоретиноина); беременность или кормление грудью.

Все посещения врача в рамках исследования проходили с 9 до 18 ч с июня 2019 года по февраль 2020-го. Для оценки состояния здоровья глаз проводился осмотр с использованием щелевой лампы по шкале CCLRU [45]. Слезная секреция измерялась на левом глазу с помощью полоски Ширмера (TearFlo, HUB Pharmaceuticals, Скоттсдейл, штат Аризона). Полоску брали руками в перчатках и вынимали через 5 мин или тогда, когда она полностью намокала. Затем эту полоску помещали в чистую пробирку Эппендорфа для забора слезы. В течение часа после сбора ее переносили во льду в морозильную камеру с температурой –80 °C и хранили до анализа партии.

Материалы

Бутилированная вода класса LC-MS (пригодная для жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией – ЖХМС), ацетонитрил (ACN), муравьиная кислота (FA) и трипсин для секвенирования были при­обретены у Thermo Fisher Scientific (Питтсбург, штат Пенсильвания, США); пептиды iRT – у Biognosys AG (Швейцария). Все остальные химические вещества закупались у компании Millipore Sigma (Сент-Луис) и использовались без дополнительной очистки, если не указано иное.

Подготовка образцов

Каждый образец полоски Ширмера разрезали на куски с помощью стерильного лезвия и погружали в 100 мкл раствора бикарбоната аммония (100 мМ) в пробирке объемом 1,5 мл. Реакции восстановления и алкилирования проводили путем добавления соответственно дитиотреитола (5 мМ) при 37 °C в течение 1 ч и йодо­ацетамида (10 мМ) на протяжении 30 мин в темноте. Затем добавляли трипсин (1:40 вес/вес) и инкубировали при 37 °C в течение ночи. Реакцию останавливали, добавляя три­фторуксусную кислоту. После центрифугирования расщепленные пептиды очищали с использованием хроматографических наконечников C18 Ziptip и высушивали в вакууме с помощью CentriVap (Labconco). Каждый высушенный образец ресуспендировали в 2 %-м ацетонитриле с 0,1 %-й муравьиной кислотой для ЖХМС.

Жидкостная хроматография с масс-спектрометрией

Жидкостная хроматография проводилась на масс-спектрометре timsTOF Pro (Bruker Daltonics, Германия), подключенном к источнику ионов CaptiveSpray. Образцы пептидов (~200 нг) наносили на собственную набивную колонку ReproSil-Pur C18 1,9 мкм (Dr. Maisch GmbH, Германия), 75 мкм × 25 см, температура колонки 40 °C) с буфером A (0,1 %-я муравьиная кислота в воде) и буфером B (0,1 %-я муравьиная кислота в ацетонитриле) в качестве подвижных фаз. 120-минутный градиент составлял 60 мин с буфером В 2–17 %, 90 мин с B до 25 %, 100 мин c B до 37 %, 110 мин с B до 80 % и поддерживался еще 10 мин. Использовалась технология diaPASEF с отношением массы к заряду 64 m/z и заданной выборке подвижных ионов. Напряжение электрораспыления составляло 1,4 кВ, а температура ионообменной трубки – +180 °C. Полные сканы были получены в диапазоне 150–1700 m/z. Энергия столкновения линейно изменялась в зависимости от подвижности: от 27 эВ при 1/K0 = 0,85 см2/(В · с) до 45 эВ при 1/K0 = 1,3 см2/(В · с).

Биоинформатика и статистический анализ

Идентификация и количественный анализ пептидов и белков

Для идентификации и количественного определения пептидов и белков использовалось программное обеспечение (ПО) Spectronaut версии 15 (Biosynosis, Швейцария) с настройками по умолчанию [46]. Коротко говоря, стратегия допуска по динамической массе применялась для извлечения как MS1, так и MS2, и поправочный коэффициент не использовался. Калибровка пептидов iRT выполнялась с помощью метода локальной (нелинейной) регрессии. Для создания ловушек использовался метод мутировавших ловушек. Была включена коррекция интерференции, чтобы при всех прогонах исключить из количественного определения фрагментные ионы с интерференцией. Использовалась собственная библио­тека спектров биологических образцов человека. Ее создали с помощью применения модифицированной процедуры, описанной в исследовании Цинь (Qin) и соавторов [47]. Если вкратце, для этой цели было проведено 32 сканирования DDA с разделенными клетками эпителия роговицы и образцами слезы человека, фракционированными с высоким pH. Данные обрабатывались с использованием программного поискового механизма Spectronaut’s Pulsar с настройками по умолчанию. Применялась база UniProt-SwissProt Home Sapiens (Taxon ID 9606, загружена 30.01.2021, 42383 записи). В качестве фиксированной модификации было выбрано карбамидометилирование цистеина, а в качестве переменных модификаций – окисление и ацетилирование метионина. Длина пептида была установлена в диапазоне 7–52, допускались два пропущенных расщеп­ления. Прекурсоры с количеством фрагментов меньше трех были исключены из библиотеки спектров. Частота ложноположительных результатов (ЧЛР) контро­лировалась на уровне < 1 % при совпадении спектра пептидов, их уровней и белков. Для обработки данных diaPASEF ЧЛР контролировалась на уровне < 1% как для пептидов, так и для белков. Чтобы определить количество представляющих интерес белков, применялась программа Skyline [48] (версия 22.1.9.208). Длина пептида была установлена в диапазоне 6–50. Массы ионов-предшественников и ионов-продуктов были установлены моноизотопными; заряды ионов-предшественников – 2–6, а заряды ионов y- и b-типов – 1–4. Допуск совпадения ионов составлял 0,05 m/z. Минимальное и максимальное значения m/z составили 100 и 1800 соответственно. Остальные параметры были такими же, как указано выше. Необработанные результаты масс-спектрометрии и поиска были переданы в консорциум ProteomeXchange посредством базы данных PRIDE (PRoteomics IDEntifications) [49] с идентификатором набора данных PXD029188.

Статистический анализ

Все статистические анализы проводились с использованием ПО R версии 4.1.0. Демографические и клинические данные субъектов сравнивались с использованием однофакторного дисперсионного анализа, критерия Крускала – Уоллиса и критерия хи-квадрат для непрерывных, порядковых и категориальных типов данных соответственно. Для нормализации данных количественного определения белка применяли log2-трансформацию и нормализацию медианы. Для сравнительного анализа содержания белка при статистическом тестировании использовались только белки, идентифицированные более чем в 80 % образцов. Анализ на уровне белка проводили с использованием эмпирических байесовских модерируемых тестов, реализованных в программном пакете R/Bioconductor limma [50]. В частности, метод Limma использует подход линейной модели для анализа экспрессии генов или содержания белка в ковариатах. В отличие от обычной линейной модели, основанной на методе наименьших квадратов, для подгонки модели к уровню экспрессии отдельного белка Limma использует эмпирический байесовский подход. Сила разных белков берется для оценки среднего значения и дисперсии содержания белка, проверки контраста параметров модели, представляющих научный интерес. P-уровни модерируемого t-теста нескольких белков дополнительно корректируются с использованием метода частоты ложных результатов Бенджамини – Хохберга. Таким образом, статистический метод Limma позволяет справиться с трудностями, характерными для небольшой выборки; он отличается высокой точностью и используется для сравнительного анализа протеомных данных [51]. Статистически значимыми считались только белки со скорректированным p-уровнем ниже порога (альфа = 0,05) и кратным изменением содержания ≥ 2 (абсолютное значение log2 (кратное изменение) ≥ 1). Уникальными считались белки, имеющиеся во всех образцах одной группы, но не присутствующие ни в одной другой группе. Были классифицированы термины биологического процесса генной онтологии (ГО), связанные с идентифицированными белками; анализ обогащения выполнялся с использованием програм­много пакета Rgprofiler2 [52]. В частности, с его помощью реализован кумулятивный гипергеометрический тест для анализа обогащения с использованием метода g:Profiler. При данном методе проводится коррекция нескольких тестов, чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов. Учитывается перекрытие функциональных терминов и взаимозависимость тестов. Следовательно, этот метод более консервативный по сравнению с методом Бенджамини – Хохберга и менее ограничивающий, чем метод поправки Бонферрони. g:Profiler сообщает о скорректированных значениях p-обогащения. Классификация белков и анализ путей роста белковых структур проводились с использованием си­стемы классификации PANTHER (анализ белков через эволюционные отношения) [53, 54]. PANTHER в качестве алгоритма по умолчанию реализует точный тест Фишера с коррекцией частоты ложных результатов Бенджамини – Хохберга для множественного тестирования.

Результаты

Демографические и клинические характеристики лиц, участвовавших в исследовании

Демографические данные и характеристики поверхности глаз пользователей очков, ОК-линз и МКЛ показаны в табл. 1. В группе участников, носящих очки, был более широкий возрастной диапазон, и они были примерно на 4–5 лет моложе, чем респонденты, использующие ОК-линзы (p = 0,04), но достоверных отличий от пользователей МКЛ нет (p = 0,08). В целом, результаты обследования с помощью щелевой лампы были в ожидаемых пределах нормы для детей и молодых людей, носящих очки и КЛ. Не наблюдалось никаких существенных различий между группами по продолжительности использования, секреции слезы, покраснению и шероховатости век, состоянию сосочков, лимбальному и бульбарному покраснению, ДМЖ или окрашиванию роговицы.

Таблица 1
Демографические и клинические характеристики участников исследования

Данные протеомики

Количество белковых групп, идентифицированных у каждого субъекта, варьировало от 889 до 3082 (рис. 1а), что свидетельствует о неоднородности состава слезного протеома у разных людей. Распределение содержания белка и графики анализа основных компонентов показаны на рисунках S1 и 2, которые можно найти в дополнительных материалах. Среднее количество белковых групп, идентифицированных в каждой группе оптической коррекции, составляло 1978 для очков, 1756 для ОК-линз и 2009 для пользователей МКЛ (обозначены черными полосами на рис. 1а). Не было никаких существенных различий между всеми тремя группами в количестве идентифицированных белков. Всего было идентифицировано 3206, 3139 и 3134 белковых групп в группах с очками, ОК-линзами и МКЛ соответственно. Во всех трех группах идентифицировано 3406 белковых групп – самое большее количество белков, идентифицированных в образцах слезных полосок Ширмера. Классификация, основанная на категориях генной онтологии, показана в дополнительном материале на рис. S3. 2910 групп белков были идентифицированы как минимум в одном образце из каждой корректирующей группы, что составляет 85,4 % от общего количества белков, идентифицированных в этом исследовании (рис. 1б). Высокое перекрытие между различными группами оптической коррекции указывает на то, что состав слезного протеома в них был одинаковым.


Рис. 1.
а – количество белковых групп, идентифицированных у каждого участника, носящего очки, ОК-линзы или МКЛ (черные линии показывают среднее количество белковых групп); б – диаграмма Венна, которая показывает перекрытие и уникальность идентифицированных белков в каж­дой группе участников; в – количество белков в слезе, выделенной из полосок Ширмера, судя по научным публикациям с 2015 по 2021 год

Влияние типа линзы на протеом слезы

В общей сложности были идентифицированы и использованы для статистического анализа 925 белков в > 80 % образцов слезы всех 22 участников. Не было существенных различий по содержанию белка ни между участниками, использующими очки и ОК-линзы, ни между участниками, которые носят очки и МКЛ (рис. 2а, б). У участников, носящих МКЛ и ОК-линзы, после учета поправки на возраст было обнаружено, что 19 групп белков по-разному экспрессировались (рис. 2в). Из них 8 белковых групп были активизированы, а 11 – подавлены у участников, применяющих МКЛ, если сравнивать их с теми, кто использует ОК-линзы. Эти белки были разделены на пять категорий по классификации PANTHER. Для каждой категории показано количество белков с повышенной и пониженной экспрессией в группе пользователей МКЛ (рис. 2г). В табл. 2 перечис­лены идентификаторы UniProt ID, гены и названия этих 19 групп белков, их классы. Все защитные иммунные белки, такие как тяжелый вариабельный домен иммуноглобулина 1–46 (IGHV1–46), были усилены в группе участников, носящих МКЛ, по сравнению с теми, кто использует ОК-линзы. Все четыре фермента взаимопревращения метаболитов, такие как, например, фактор торможения миграции макрофагов (MIF), были снижены в группе использующих МКЛ по сравнению с теми, кто носит ОК-линзы. На рис. 2д показано, что многие белки участвуют в сигнальных, иммунных и воспалительных реакциях. Полный список идентификаторов генной онтологии и терминов включен в таблицу дополнительных материалов S1.


Рис. 2.
а–в – графики рассеяния, показывающие сравнительное содержание белка в группах участников, использующих ОК-линзы и очки, МКЛ и очки, МКЛ и ОК-линзы соответственно. Пунктирными линиями обозначены пороговые значения p после нескольких корректировок тестирования и кратного изменения содержания белка; г – классификация белков, дифференциально экспрессируемых в группах участников, носящих МКЛ и ОК-линзы ( – ниже, – выше); д – генные онтологические биопроцессы с участием белков, дифференциально экспрессируемых в группах пользователей МКЛ и ОК-линз

Таблица 2
Список групп белков, в котором показано их различное содержание в группах пользователей МКЛ и ОК-линз, а также классификация PANTHER

Влияние возраста на протеомы слезы

Чтобы оценить влияние возраста на белковый состав, использовались профили протеома слезы носителей очков. Лиц моложе 18 лет отнесли к категории детей (n = 5), а лиц от 18 лет и старше – ко взрослым (n = 5). Выяснилось, что содержание 82 групп белков отличается: 67 из них у детей встречаются чаще, а 15 – реже, если сравнивать с молодыми взрослыми (рис. 3а). Анализ обогащения генной онтологии показал 18 обогащенных биологических процессов с участием 82 белков, в том числе 25 белков, участвующих в защитном ответе (GO:0006952), 15 – в ответе врожденного иммунитета (GO:0045087), 14 – в воспалительном ответе (GO:0006954), и 9 – в процессе метаболизма гликопротеинов (GO:0009100) (рис. 3б). Полный список дифференциально экспрессируемых белков и связанных с ними идентификаторов генной онтологии и терминов включен в таблицы дополнительных материалов S2 и 3. Кроме того, мы разделили эти 82 группы белков на 12 классов белков PANTHER; для каждой категории показано количество белков с повышенной и пониженной экспрессией у детей (рис. 3в). Четыре белка являются защитными/иммунными; из них три белка активизированы [иммуноглобулин с тяжелой константой гамма-4 (IGHG4), богатый цистеином секреторный белок-3 (CRISP3) и  бета-2-мик­роглобулин (B2M)], а один [тяжелый вариабельный иммуноглобулин 1–45 (IGHV1–45)] снижен у детей по сравнению со взрослыми. У детей повышалась активность всех пяти межклеточных сигнальных молекул, включая хемокины 10 (CXCL10) и 17 (CXCL17) с C-X-C-мотивом. Из 18 ферментов взаимопревращения метаболитов содержание 12 у детей было повышено – например, полипептидов N-ацетилгалактозаминилтрансферазы 3 и 5 (GALNT3 и GALNT5), CMP-N-ацетилнейраминатин-бета-галактозамид-альфа-2,3-сиалилтрансферазы 1 (ST3GAL1) и бета-1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1). Напротив, шесть ферментов, в том числе MIF, были подавлены у детей по сравнению с молодыми людьми.


Рис. 3.
а – график рассеяния содержания белка у взрослых и детей; б – анализ обогащения генной онтологии дифференциально экспрессируемых белков. Бóльший размер круга означает бóльшее количество белков в термине; в – классификация дифференциально экспрессируемых белков у взрослых и детей ( – ниже, – выше) 

Обсуждение

Протеомика на основе масс-спектромет­рии широко использовалась для обнаружения биомаркеров и проверки результатов клинических исследований, потому что она дает огромные возможности глубокой характеризации сложных протеомов. Такие исследования часто требуют беспристрастных методов, комплексных и количественных [35, 40, 55]. При использовании технологии, основанной на DDA, для фрагментации отбираются ионы-предшественники. Поэтому, если содержание белка низкое, DDA часто дает плохо воспроизводимые результаты при идентификации и количественном определении белка. При использовании DIA на фрагментацию отправляются все ионы в каждом заранее заданном диапазоне масс. Поэтому с помощью данной технологии можно получить более полные и воспроизводимые результаты, и она идеально подходит для клинических исследований с большой выборкой [40]. К тому же при подходе PASEF ионы сначала накапливаются, а затем высвобождаются в зависимости от их подвижности, что значительно повышает чувствительность обнаружения [36, 43, 44].

В этой работе мы использовали подход diaPASEF и распознали в среднем около 2 тыс. белков за один проход, в общей сложности 3406 белковых групп – на сегодняшний день это наибольшее количество белков, идентифицированных в слезе. Сведения о белках в слезе человека, идентифицированных с помощью полосок Ширмера, опубликованные в литературе с 2015 по 2021 год [16, 20, 56–78], показывают, что ранее регистрировалось самое большее 2172 белка [78] (см. рис. 1в). Следует отметить, что во многих исследованиях сообщается количество не всех идентифицированных белков, а только тех, которые имеют значительные изменения. Поэтому такие исследования мы не учитываем. Большой разброс в количестве идентифицированных белков в опубликованной литературе (от нескольких сотен до более чем 2 тыс.) может быть связан с несколькими причинами. В их числе – условия жидкостной хроматографии и разделение образца на несколько фракций, что значительно увеличивает количество идентифицированных белков.

Применение инструментов технологии «омик» на основе масс-спектрометрии для изучения миопии было обобщено в обзорной статье Гроховски (Grochowski) и соавторов [79]. Однако пока недостаточно исследований молодых пациентов с миопией, несмотря на тот факт, что осложнения, связанные с КЛ, наиболее часты у пациентов в возрасте 15–25 лет [8–11]. В этом исследовании мы профилировали протеомы слезы у лиц в возрасте от 10 до 26 лет, которые носили очки, ОК-линзы или МКЛ более 3 лет. У этих пациентов не было активного воспаления поверхности глаза, поэтому они считались «здоровыми» пользователями. Содержание белка в слезе в группах тех, кто носил ОК-линзы и очки или МКЛ и очки, существенно не различалось. Этот вывод противоречит нескольким опубликованным исследованиям [20, 80]. Помимо прочего, это может объясняться популяционной выборкой (например, возрастной группой), состоянием здоровья поверхности глаза, методами сбора образцов и статистического анализа. Влияние возраста и метода сбора образцов на протеомы слезы будет обсуждаться далее. С учетом возраста у пользователей МКЛ и ОК-линз было выявлено 19 групп дифференциально экспрессируемых белков.

Из 19 групп белков, которые различались у участников, носящих МКЛ и ОК-линзы, ряд из них вызван воспалением и иммунитетом. Это белки, связанные с апоптозом, пятнистые белки, содержащие CARD (PYCARD), MIF и IGHV1-46. Белок PYCARD является частью инфламмасомного полимерного комплекса – белка-3 (NLRP3), содержащего домены NACHT, LRR и PYD [81]. Инфламмасома играет ключевую роль в воспалении и врожденном иммунитете. Она опосредует процессинг и секрецию провоспалительных цитокинов интерлейкина-1β (IL1β) и IL18 в ответ на инфекцию и повреждение клеток [81]. Сообщалось об активации инфламмасомы NLRP3 в слезах пациентов с синдромом сухого глаза (ССГ) [82]. Белок MIF является провоспалительным цитокином [83], необходимым для сборки и активации воспалительных процессов NLRP3, а ингибирование MIF подавляет NLRP3-зависимую секрецию IL1β и IL18 [84]. Ранее сообщалось о белке IGHV1-46 в слезах пациентов с ССГ, было предложено считать его биомаркером воспаления поверхности глаза [85]. В данном исследовании изменение количества PYCARD, MIF и IGHV1-46 у пользователей ОК-линз по сравнению с теми, кто носит МКЛ, предполагает различные глазные иммунные/воспалительные реакции. Кроме того, ингибиторы протеазы цистатин-B (CSTB) и цистатин-SN (CST1) также по-разному экспрессировались у участников, использующих МКЛ и ОК-линзы. Ингибиторы протеазы особенно важны для поддержания тканевого гомеостаза. Белок CSTB был обнаружен в слезной пленке [86, 87], и его содержание было повышенным при ношении жестких КЛ по сравнению с МКЛ [20]. Это согласуется с нашими выводами.

Итак, в данном исследовании идентифицированы несколько белков, содержание которых в слезной пленке молодых пациентов существенно повышается в ответ на ношение КЛ. Эти белки могут играть роль в воспалении глаз и поддержании глазного гомеостаза. Все участники исследования были молодыми людьми, которые постоянно носили КЛ (более 3 лет) и не имели активных глазных осложнений. Поэтому разница в содержании белка может указывать на адаптацию глаз к ношению мягких и жестких КЛ. В будущем необходимы проспективные исследования для изучения потенциальных связей между этими белками и осложнениями, вызванными ношением КЛ.

Чтобы понять, как возраст влияет на протеомы слезы, мы разделили группу пользователей очков на детей и взрослых и обнаружили, что 82 белка в этих двух подгруппах экспрессируются по-разному. Многие из них связаны с воспалением и иммунитетом, такие как CXCL10, CXCL17, PYCARD, MIF, IL18 и SERPINA3. Белок CXCL10, провоспалительный цитокин, используется клетками роговицы для связи с нейтрофилами [87] и участвует в воспалении и инфекции глаз [88–89]. Его содержание повышается в слезах пациентов с острым фолликулярным конъюнктивитом [90]; он рассматривался как предполагаемый биомаркер ССГ [70, 91–94]. В целом, очевидно, что белок CXCL10 участвует в воспалительных заболеваниях глаз. Белок CXCL17, хемокин слизистых оболочек, действует как ингибитор воспаления, поддерживающий иммунный гомеостаз при воспалительных состояниях [95-98]. Как CXCL10, так и CXCL17 были сверхэкспрессированы у детей по сравнению с молодыми людьми. IL18 представляет собой провоспалительный цитокин, высвобождаемый при активации инфламмасомы NLRP3 [99]. Вместе с MIF и PYCARD, как описано выше, они участвуют в воспалении глаз и иммунитете. SERPINA3 – это белок, отвечающий за опосредование воспалительных реакций, и его активация может быть признаком повышенного уровня воспаления глаз [29, 64, 100]. В данном исследовании эти белки по-разному экспрессировались у детей и молодых людей, что свидетельствует о различиях в воспалениях глазной поверхности и иммунных состояниях.

Среди белков, по-разному экспрессируемых у детей и молодых взрослых, есть многие ферменты взаимопревращения метаболитов, участвующие в синтезе и деградации муцинов и других типов гликанов. Гликаны и гликоконъюгаты отвечают за целостность поверхности глаза и регулируют ее взаимодействие с внешней средой [101–103]. Поэтому предполагается, что изменение количества этих ферментов является индикатором заболеваний глазной поверхности [104–105]. GALNT3 и GALNT5, ST3GAL1 и B4GALT1 участвуют в синтезе муциновых гликанов О-типа на поверхности глаза [106–109]. Заболевания глаз, такие как глазной рубцовый пемфигоид, изменяют распределение гликозилтрансфераз GALNT, и по мере прогрессирования заболевания экспрессия ферментов GALNT может быть утрачена [106]. Нейтральная альфа-глюкозидаза AB (GANAB), альфа-1,3-маннозилгликопротеин 2-бета-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза (MGAT1) и альфа-N-ацетилглюкозаминидаза (NAGLU) участвуют в биосинтезе N-гликанов. Снижение активности GANAB в слезах пациентов с ССГ указывает на нарушение функции глазного барьера [29]. Резкое снижение содержания MGAT1 вызывает частичную потерю другого белка MUC16 (как в целом, так и на клеточной поверхности) и сопутствующее снижение барьерной функции гликокаликса [110]. Белки альфа-субъединица бета-гексозами­нидазы (HEXA) и NAGLU участвуют в деградации гликозаминогликанов. HEXA и галектин-3-связывающий белок (LGALS3BP) были подавлены в слезах пациентов с ССГ [111], что указывает на нарушение функции глазного барьера. Все эти белки вносят свой вклад в поддержание гомеостаза поверхности глаза. В текущем исследовании они по-разному экспрессировались в слезах детей и молодых людей, что указывает на разный гомеостаз поверхности глаза в этих возрастных группах. Ношение КЛ отрицательно влияет на плотность муцина на поверхности глаза [112]. Поэтому возникает соблазн предположить, что эти белки, участвующие в синтезе и деградации гликанов на поверхности глаза, способствуют его возрастным реакциям на ношение КЛ.

Известно, что старение влияет на все отделы глаза [113–123]. В недавнем исследовании Нэттинен (Nättinen) и соавторы [124] идентифицировали 17 белков слезы, достоверно коррелирующих с возрастом. Многие из них связаны с воспалением, иммунным ответом и гибелью клеток, что согласуется с нашими выводами. Белок маммаглобин-А (SCGB2A2) обычно идентифицируется как по-разному экспрессируемый в цитируемом и нашем исследованиях. SCGB2A2 положительно коррелировал с увеличением возраста [124], что согласуется с нашими выводами. Тем не менее идентификация большого количества неперекрывающихся белков в этих двух исследованиях может быть связана с целым рядом факторов: состоянием здоровья глаз (после глазной операции по сравнению со здоровыми глазами без хирургии в анамнезе), возрастом пациента (взрослые от 18 до 83 лет; дети и молодые люди от 10 до 26 лет), методом сбора слезы (микрокапиллярные трубки или полоски Ширмера). Метод сбора слезы влияет на состав протеома слезы и содержание белков, что дополнительно обсуждается далее.

У нашего исследования есть ряд ограничений. Гендерный состав не сбалансирован, большинство испытуемых были женщинами. Лица моложе 18 лет оценивались только в группе пользователей очков, размер выборки был небольшим. Кроме того, вызывает беспокойство относительно большое временнóе окно сбора образцов: возможно, изменчивость протеома вызвана циркадными колебаниями (есть подобные сообщения о белках в слюне [125–126]). Метод сбора слезы может влиять на состав и содержание белков [73, 127]. Из-за контакта полоски Ширмера с поверхностью глаза в образец слезы могут попасть глазные клетки. Сравнение результатов разных исследований бывает проблематичным из-за того, что собиралась слеза разного типа (рефлекторная или базальная). Несмотря на эти ограничения, наше открытие привлекает внимание к возрастным различиям протеома поверхности глаза, особенно у детей. Кроме того, программа Skyline помогла обнаружить, что большинство дифференциально экспрессируемых белков (54 из 82) значительно различаются у детей и молодых людей. У них самый высокий риск развития осложнений, вы­званных КЛ. Вероятно, что реакция глаз на КЛ в этих двух группах будет отличаться. Поэтому необходимы дальнейшие исследования среди детей – пользователей КЛ.

Заключение

Используя подход diaPASEF, мы идентифицировали 3406 белков в образцах слезы, собранных с помощью полосок Ширмера. Выяснилось, что содержание 19 белковых групп значительно отличалось в группе пользователей МКЛ по сравнению теми, кто применяет OK-линзы. Содержание в слезе 82 белков отличалось у детей и молодых людей, использующих очки. Наличие многих важных белков связано с воспалением и иммунитетом, а также с гомеостазом поверхности глаза. В целом, данное исследование дает глубокий охват протеома слезы и предполагает необходимость изучения реакции глаз на ношение КЛ отдельно для подростков и молодых людей.

Авторы исследования: Готин Цинь (Guoting Qin), Колледж оптометрии при Хьюстонском университете (Хьюстон, США), Лаборатория масс-спектрометрии, химический факультет, Хьюстонский университет (Хьюстон, США); Сесилия Чао (Cecilia Chao), Колледж оптометрии при Хьюстонском университете (Хьюстон, США), Школа оптометрии и науки о зрении, Университет Нового Южного Уэльса (Сидней, Австралия); Лорен Дж. Лэттери (Lauren J. Lattery), Колледж оптометрии при Хьюстонском университете (Хьюстон, США); Хун Линь (Hong Lin), факультет компьютерных наук и инженерных технологий, Хьюстонский университет (Хьюстон, США); Вэньцзян Фу (Wenjiang Fu), факультет математики, Хьюстонский университет (Хьюстон, США); Кэтрин Ричдейл (Kathryn Richdale), Колледж оптометрии при Хьюстонском университете (Хьюстон, США); Чэнчжи Цай (Chengzhi Cai), Лаборатория масс-спектрометрии, химический факультет, Хьюстонский университет (Хьюстон, США).

Перевод: Н. Вахтина

Статья опубликована на сайте ScienceDirect 01.10.22. Печатная публикация статьи запланирована к выходу в журнале Journal of Proteomics 06.01.2023. © 2022 Elsevier B.V. All rights reserved

© РА «Веко»

Печатная версия статьи опубликована в журнале «Современная оптометрия»  [2022. № 9 (158)].

По вопросам приобретения журналов и оформления подписки обращайтесь в отдел продаж РА «Веко»:

  • Тел.: (812) 634-43-34.
  • E-mail: magazine@veko.ru
  • veko.ru

Наши страницы в соцсетях:

Ближайшие события